Даже Caenorhabditis elegans, крошечный червь, обычно используемый в биологических исследованиях, может иметь до 3000 клеток. Итак, как вы отслеживаете пару микроскопических пятнышек среди всего этого?

Одиночные клетки, проходящие через печень мыши, выделяются новой техникой визуализации, разработанной в лаборатории Михаила Шапиро. Предоставлено: Калтех / Дэниел Сойер, лаборатория Шапиро.

Ученые, работающие в лаборатории Калифорнийского технологического института Михаила Шапиро, профессора химической инженерии и исследователя Института медицинских исследований наследия, нашли способ.

В новом методе используются так называемые акустические репортерные гены, первопроходцем в разработке которых был Шапиро. Чтобы понять акустические репортерные гены, сначала знайте, что репортерные гены - это специализированный фрагмент ДНК, который исследователи могут вставить в геном организма, чтобы помочь им понять, что он делает. Исторически репортерные гены кодировали флуоресцентные белки. Например, если исследователь вставляет один из этих репортерных генов рядом с геном, который он хочет изучить, - скажем, геном, отвечающим за развитие нейронов, - активация этих генов нейронов также будет производить флуоресцентные белковые молекулы.

Когда на эти ячейки попадает правильный свет, они загораются, как маркер, который может пометить определенный отрывок в книге.

Однако у этих флуоресцентных репортерных генов есть большой недостаток: свет не проникает очень далеко через живые ткани.

Итак, Шапиро разработал репортерные гены, которые используют звук вместо света. Эти гены, вставленные в геном клетки, вызывают образование микроскопических полых белковых структур, известных как газовые везикулы. Эти пузырьки обычно обнаруживаются у некоторых видов бактерий, которые используют их, чтобы оставаться на плаву в воде, но они также обладают полезным свойством «звенеть» при ударе ультразвуковыми волнами.

Идея состоит в том, что когда клетка, производящая эти везикулы, визуализируется с помощью ультразвука, она посылает акустический сигнал, сообщающий о своем присутствии, позволяя исследователям видеть, где она находится и что делает. Этот метод использовался для демонстрации активности ферментов в клетках в предыдущей работе лаборатории Шапиро.

В своей последней статье исследовательская группа описывает, как она настолько увеличила чувствительность этой техники, что теперь она может отображать одну клетку, расположенную в ткани тела, которая несет акустический репортерный ген.

«По сравнению с предыдущей работой над газовыми пузырьками, эта статья позволяет нам увидеть гораздо меньшие количества этих газовых пузырьков», - говорит Дэниел Сойер (PhD \'21), ведущий автор и бывший аспирант по биоинженерии в лаборатории Шапиро. «Это похоже на переход от спутника, который может видеть огни небольшого городка, к спутнику, который может видеть свет от единственного фонарного столба».

Их усовершенствования представляют собой увеличение более чем в 1000 раз чувствительности по сравнению с предыдущей техникой, которую они использовали для визуализации клеток, несущих акустические репортерные гены. Разница заключается в том, какой ультразвук они используют, и в том, как на него реагируют газовые пузырьки.

В то время как предыдущая методика визуализации полагалась на везикулы, звенящие, как колокольчик, в который ударили, в новом методе используется более сильный ультразвук, который «выскакивает» везикулы, как воздушный шар.

«Везикулы в этот момент производят очень сильный сигнал», - говорит Шапиро. «Затем пузырьки лопаются и перестают подавать сигнал. Мы ищем маленькую метку ».

Это пятно настолько четкое, что исследователи могут легко его обнаружить даже среди всего фонового шума, создаваемого ультразвуком, проникающим через ткани. Шапиро говорит, что недавняя работа над созданными штаммами инъекционных бактерий, которые атакуют раковые клетки, или бактерии, «возвращающие опухоль», создает потребность в лучших способах отслеживания этих клеток, чтобы увидеть, в какую часть тела они попадают. Исследователи показали, что, когда бактерии были сконструированы так, чтобы нести ген газовых везикул, можно было отслеживать отдельные бактериальные клетки, когда они проникали и перемещались через печень после попадания в кровоток.

Сойер говорит, что такой уровень чувствительности необходим, если исследователи хотят использовать ультразвук для изучения состава кишечного микробиома, который в случае нарушения может влиять на такие состояния, как болезнь Альцгеймера и аутизм.

«В вашем кишечнике так много видов бактерий, а некоторые настолько редки, что вам нужно что-то достаточно чувствительное, чтобы увидеть лишь некоторые из них глубоко внутри тела», - говорит он.

Вредят ли везикулы внутри клеток? Нет, не совсем.

«Короткий ответ - нет, а длинный ответ - нет в большинстве практических случаев», - говорит Сойер. «Бывают случаи, когда отдельные бактериальные клетки, которые очень малы и имеют очень большое количество этих газовых пузырьков, повреждаются, но это не имеет большого значения для бактериальной популяции, если некоторые из них становятся менее жизнеспособными. А в клетках млекопитающих мы не увидели отрицательного эффекта ».

Шапиро и Сойер идут по двум направлениям в своих исследованиях. Один путь будет основан на том, что исследователи уже разработали для создания более совершенных методов визуализации. Это будет включать конструирование и тестирование новых видов везикул, которые имеют разные свойства, например, везикулы, которые легче лопаются, или везикулы, которые более устойчивы, или везикулы меньшего размера, которые могут поместиться в местах, которые не могут поместиться более крупными везикулами. Другой путь - найти практическое применение разработанной ими технологии, - говорит Сойер.

«В области оптической микроскопии произошла совместная эволюция оптических датчиков и методов микроскопии с такими методами, как двухфотонная микроскопия и микроскопия световых пучков. [both are types of fluorescent microscopy], - говорит Шапиро. «Работа Дэнни является частью разработки ультразвукового аналога этих методов визуализации».