Исследователи разработали «мини» систему редактирования генома CRISPR

«CRISPR может быть таким же простым, как резак, или более продвинутым, как регулятор, редактор, этикетировщик или имидж-сканер. Многие приложения появляются в этой захватывающей области », — сказал Ци, который также является доцентом кафедры химической и системной биологии Стэнфордской школы медицины и стипендиатом Стэнфордского института ChEM-H.

CRISPR-ассоциированный белок Cas9 (белый) из Staphylococcus aureus на основе базы данных белков с идентификатором 5AXW. Предоставлено: Томас Сплеттстессер — CC BY-SA 4.0.

Однако множество различных систем CRISPR, которые используются или проходят клинические испытания для генной терапии заболеваний глаз, печени и головного мозга, по-прежнему ограничены по своему охвату, поскольку все они страдают одним и тем же недостатком: они слишком велики и, следовательно, тоже трудно доставлять в клетки, ткани или живые организмы.

В статье, опубликованной 3 сентября в Молекулярная клетка, Ци и его сотрудники объявляют о том, что, по их мнению, является важным шагом вперед для CRISPR: эффективной, многоцелевой мини-системой CRISPR. В то время как обычно используемые системы CRISPR — с такими названиями, как Cas9 и Cas12a, обозначающими различные версии CRISPR-ассоциированных (Cas) белков — состоят примерно из 1000-1500 аминокислот, их «CasMINI» состоит из 529.

В ходе экспериментов исследователи подтвердили, что CasMINI может удалять, активировать и редактировать генетический код, как и его более мощные аналоги. Его меньший размер означает, что его будет легче доставлять в клетки человека и организм человека, что делает его потенциальным инструментом для лечения различных заболеваний, включая болезни глаз, дегенерацию органов и генетические заболевания в целом.

Настойчивые усилия

Чтобы сделать систему как можно меньше, исследователи решили начать с белка CRISPR Cas12f (также известного как Cas14), поскольку он содержит всего около 400-700 аминокислот. Однако, как и другие белки CRISPR, Cas12f естественным образом происходит от архей — одноклеточных организмов, что означает, что он не очень хорошо подходит для клеток млекопитающих, не говоря уже о клетках или телах человека. Известно, что только несколько белков CRISPR работают в клетках млекопитающих без модификации. К сожалению, CAS12f не входит в их число. Это создает заманчивую задачу для таких биоинженеров, как Ци.

«Мы подумали:« Хорошо, миллионы лет эволюции не смогли превратить эту систему CRISPR во что-то, что функционирует в человеческом теле. Можем ли мы изменить это всего за один или два года? »- сказал Ци. «Насколько мне известно, мы впервые превратили неработающий CRISPR в рабочий».

Действительно, Сяошу Сюй, научный сотрудник лаборатории Ци и ведущий автор статьи, не обнаружил активности природного Cas12f в клетках человека. Сюй и Ци предположили, что проблема заключалась в том, что ДНК генома человека более сложна и менее доступна, чем ДНК микробов, из-за чего Cas12f трудно найти свою цель в клетках. Изучив расчетно предсказанную структуру системы Cas12f, она тщательно выбрала около 40 мутаций в белке, которые потенциально могли бы обойти это ограничение, и создала конвейер для одновременного тестирования множества вариантов белка. Теоретически рабочий вариант мог бы превратить человеческую клетку в зеленый цвет, активируя зеленый флуоресцентный белок (GFP) в ее геноме.

«Сначала эта система вообще не работала в течение года», — сказал Сюй. «Но после итераций биоинженерии мы увидели, как некоторые искусственно созданные белки начали включаться, как по волшебству. Это заставило нас по-настоящему оценить силу синтетической биологии и биоинженерии ».

Первые успешные результаты были скромными, но они взволновали Сюй и воодушевили ее двигаться вперед, потому что это означало, что система работает. В ходе многих дополнительных итераций ей удалось еще больше улучшить характеристики протеина. «Мы начали с того, что увидели только две клетки, показывающие зеленый сигнал, а теперь, после разработки, почти каждая клетка под микроскопом становится зеленой», — сказал Сюй.

«В какой-то момент мне пришлось остановить ее», — вспоминает Ци. «Я сказал:« Пока все хорошо. Вы сделали довольно хорошую систему. Мы должны подумать о том, как эту молекулу можно использовать для приложений ».

Помимо белковой инженерии, исследователи также создали РНК, которая направляет белок Cas к целевой ДНК. Модификации обоих компонентов имели решающее значение для работы системы CasMINI в клетках человека. Они протестировали способность CasMINI удалять и редактировать гены в лабораторных клетках человека, включая гены, связанные с ВИЧ-инфекцией, противоопухолевым иммунным ответом и анемией. Он работал почти со всеми протестированными генами, а в некоторых был получен устойчивый ответ.

Открытие двери

Исследователи уже начали налаживать сотрудничество с другими учеными для разработки генной терапии. Их также интересует, как они могут внести свой вклад в развитие РНК-технологий — например, то, что было использовано для разработки мРНК-вакцин против COVID-19, — где размер также может быть ограничивающим фактором.

«Эта способность разрабатывать эти системы была желанной в полевых условиях с первых дней существования CRISPR, и я чувствую, что мы сделали все, что в наших силах, чтобы приблизиться к этой реальности», — сказал Ци. «И этот инженерный подход может быть очень полезным. Вот что меня волнует — открывать двери для новых возможностей ».